آزمایش تغلیظ مدفوع

[vc_row][vc_column][cz_gap][/vc_column][/vc_row][vc_row css=”.vc_custom_1588166447734{margin-right: 5% !important;margin-left: 5% !important;}”][vc_column][vc_column_text]

Stool Concentration Technique

آزمایش تغلیط نمونه مدفوع به منظور تغلیظ تخم، کیست، لارو و تروفوزوئیت انگلها برای تشخیص دقیقتر بصورت روزانه در آزمایشگاه تشخیص طبی در اصفهان دکتر شریفی انجام می شود.

هدف کلی از آزمايش مستقيم نمونه مدفوع فاقد ماده نگهدارنده، ارزیابی تحرك تروفوزوئيت تك ياخته‌ها، گزارش رنگ، قوام، ميزانگلبول سفید و قرمز وغيره می باشد. در نتیجه روش صحيح گزارش بدین گونه است كه روش مستقيم به صورت گزارش اوليه ارائه شود و گزارش نهایی روش تغليظ و رنگ آميزي دائمي بعد از انجام به اطلاع پزشك برسد.
برحسب نوع ماده فیکساتیو بر روي نمونه مدفوع آزمايش تغليظ و رنگ آميزي دائمي را می توان انجام داد. روش تغليظ می تواند به عنوان بخشی از روند كامل ارزیابی نمونه مدفوع برای جستجوي انواع انگل‌ها مي‌باشد. تعداد ارگانيسمها اگر کم باشد احتمال دارد در آزمايش مستقيم تشخيص داده نشود، به‌وسيله روش تغلیظ بهتر شناسايي می شوند.

1- روش شناور سازي (Flotation)
2- روش رسوبی (Sedimentation)
اساس اين روشها آن است كه كيست و اووسيست تك ياخته ها، تخم و لارو کرمها از مواد زائد مدفوع با عمل سانتريفوژ و يا بر اساس تفاوت در وزن مخصوص آنها از هم جدا می شوند.
1- شناورسازي با سولفات روي (Zinc sulfate flotation)
در روش شناورسازي، كيست تك ياخته ها و بعضي از تخم كرمها از مواد اضافي موجود در مدفوع، بر اساس استفاده از يك مايع با وزن مخصوص بالا، جدا مي گردند. عوامل انگلي در سطح بالایی مايع تجمع پیدا و مواد اضافي مدفوعی در ته لوله آزمایش باقي خواهند ماند. اين روش سهل تر از روش رسوبی است، در هر صورت اکثر تخم كرمها مثل تخمهاي دارای دریچه و يا تخمهاي بسیار سنگين همانند تخم کرم آسكاريس غيربارور بوسیله اين روش تغليظ نخواهند شد.
شرایط نمونه
نمونه : بایستی تازه بوده و يا در ماده نگهدارنده مانند فرمالين 5 يا 10درصد بافره و يا SAF=sodium Acetate-Acetic Acid-formalin نگهداري شود.
– جهت نمونه هاي بسیار آبكي مرحله سانتريفوژ را مي توان حذف کرد.
فرمالين 5% یا 10% بافره و يا SAF سرم فيزيولوژي 0/85 گرم درصد ، محلول سولفات روي ( محلول آبي 33 درصد)
تقریبا 330 گرم از سولفات روي را در آب دیونیزه ( 670 سی سی ) به حجم يك ليتر رسانده می شود.
وزن مخصوص محلول سولفات روی بایستی برای نمونه هاي فیکس شده در فرمالين به ميزان 20/1 و براي نمونه هاي تازه 18/1 باشد. در غير اين بایستی با اضافه کردن سولفات روي و يا آب دیونزه تنظيم شود . این محلول تا 36 ماه قابل استفاده می باشد.

روش کار:
ا- حدود 4 گرم مدفوع تازه را داخل10 ميلي ليتر فرمالين 10% ( درون يك ظرف مناسب از نظر حجم نهائي ) بربزيد. مدفوع و فرمالين راكاملاً مخلوط كنيد. مخلوط ر ا به مدت حداقل 30دقيقه جهت ثابت شدن نگه داريد. اگر نمونه در محلول نگهدارنده فرمالين و يا SAF نگهداري شده است ، مخلوط ماده نگهدارنده و مدفوع را به خوبى مخلوطكنيد.
2- نسبت به اندازه و قوام نمونه ، تعداد كافي گاز مرطوب را روي هم قرار داده و آن را داخل يك قيف بگذاريد. قيف را داخل يك لوله ته مخروطي گذاشته و حدود8 ميلي ليتر از مخلوط فوق را صاف نمائيد تا رسوبي به اندازه5/0 تا اميلي ليتر ايجاد كند. اگر نمونه در ماده نگهدارنده فرمالين و يا SAF قرار داده شده باشد ، حدود 4 – 3ميلي ليتركافي است مگر اينكه نمونه مدفوع در ابتدا كم باشد.
3- محلول سرم فيزيولوژي 85/0% را تا سر لوله اضافه كنيد و بمدت 10 دقيقه در دورg 500 سانتريفوژ نمائيد. مقدار رسوب بدست آمده بايد حدود 5/0 تا ا ميلي ليتر باشد. رسوب خيلي غليظ و يا خيلي رقيق نشاندهنده روش نادرست تغليظ است .
( روش صحيح محاسبه تعداد دور در دقيقه بر اساس شعاع ، كه در سانتريفوژهاي مختلف ، متفاوت است در كتب مرجع موجود ميباشد. )
4- مايع رويي را دور ريخته و رسوب را در ا تا 2 ميلي ليتر سولفات روي به حالت سوسپانسيون درآوريد و سپس تا 3- 2 ميلي ليتري لبه لوله را با محلول سولفات روي پر كنيد.
5- بمدت يك دقيقه در دور g500سانتريفوژ كنيد . اجازه بدهيد كه بدون هيح دخالتي سانتريفوژ كاملاًمتوقف شود.
دو لايه تشكيل مي گردد . مفدار كمي رسوب در ته لوله ويك لايه سولفات روي در بالاي لوله مشاهده مي شود.
كيست تك ياخته ها و بعضي از تخم كرمها درسطح و بعضي از تخمهاي سنگين و يا دريچه دار در رسوب قرارمي گيرند.
8- بدون اينكه لوله را از سانتريفوژ خارج كنيد ، يك يا دو قطره از سطح مايع را با كمك يك پي پت پاستور و يا يك
لوپ سيمي حرارت داده و سرد شده برداريد و روي يك لام بگذاريد.
هرگز لوپ را به طور عمقي وام د مايع نكنيد. بلكه فقط با سطح مايع آن را به طريقي تماس دهيد كه لوپ موازي با سطح
مايع قرار گيرد ( نه اينكه با آن زاويه °90 بسازد ). مطمئن باشيد كه نوك پي پت يا لوپ زير سطح مايع وارد نشود.
7. يك لامل 22 × 22و يا 24 × 22 ميليمتري روي آن قرار دهيد. جهت آماده سازي نمونه ار محلول لوگل ميتوان استفاده نمود.
8- با عدسى با بزرگنمايي ( 10 × ) تمام سطح لامل را بررسي كنيد.
9- اگر مورد مشكوكي مشاهده گرديد ، با بزركنمايي ( 40 × )براي مطالعه جزئيات بيشتر استفاده نمائيد.بايد حداقل 3/1 سطحلامل را حتي اگر مورد مشكوكي مشاهده نگرديد، بررسي كنيد .
10- قبل از آزمايش در آزمایشگاه و يا بعد از آن مي توان لام مرطوب را جهت آموزش به ديگران در يك پليت محتوي كاغذ مرطوب در روي يك اپليكاتور و يا پايه مخصوص لام قرار دهيد. هواي محفظه بايد كاملاً مرطوب باشد اما خيس نباشد .
گزارش نتايج : مثال هايي از گزارش مثبت شامل
Giardia lamblia cysts present.
Trichuris Trichura eggs present
Few macrophages present
Moderate WBCs present
مي باشد.

نكات قابل توجه در روش :
– استفاده از آب لوله كشي مي تواند جايگزين استفاده ازسرم فيزيولوژي گردد . بعضي از كاركنان ترجيح مي دهند كه در تمام مراحل روش به جاي آب از محلول فرمالين 5%يا 10% استفاده كنند.
– اگر نمونه ها در SAF نگهداري شده اند ، آزمايش از مرحله 2شروع مي شود.
– اگر در مورد نمونه هاي تازه ازآب لوله كشي استفاده شود ، ممكن است انگل بلاستوسيستيس هومينيس از بين برود. .
– اگر ترجيح مي دهيد كه جهت نمونه برداري لوله ها را از سانتريفوژ خارج نمائيد ، دقت كنيد كه قبل از نمونه برداري
سطح مايع تكان نخورد .
– بعضي از كاركنان ترجيح مي دهند كه مقدار كمي سولفات روي را به سطح لوله اضافه كرده ، به نحويكه سطح مايع يك
برآمدگي كوچك محدب شكل را تشكيل دهد و سپس يك لامل بر روي سطح آن قرار دهند.
بايد 5 دقيقه صبر نموده و در اين مدت لوله را تكان ندهيد . سپس لامل را با دقت از روي لوله برداشته و جهت بررسي روي
يك لام قرار دهيد.
محدوديتهاي روش : تك ياخته هاي مشاهده شده در نمونه بايد بوسيله روش رنگ آميزي دائمي تائيد شوند. بعضي از
تك ياخته ها كوچك بوده و تشخيص آنها با اين روش مشكل ميباشد .
بايد حداكثر در فاصله زماني 5 دقيقه بعد از توقف كامل سانتريفوژ ، سطح مايع جهت بررسى ، برداشت گردد.چون هر چه تماس ارگانيسمها با محلول سولفات روي بيشتر شود ، امكان اينكه شكل طبيعي خود را از دست دهند ، بيشتر مي باشد،
به طوريكه اگر كيست پروتوزوئرها و تخم كرم هاي داراي ديواره ضخيم بيشتر از چند دقيقه در تماس با محلول سولفات
روي با وزن مخصوص بالا قرار بگيرد ، ممكن است متلاشي شده و يا شكل طبيعي خود را از دست بدهد.
اگر از روش شناورسازي، به عنوان تنها روش تشخيصي استفاده مي كنيد ، بايد سطح مايع و هم رسوب آن را بررسي كنيد
تا مطمئن شويد كه همه ارگانيسمها را جدا نموده و تشخيص ميدهيد. بهر حال روش تغليظ فرمالين – اتيل استات ( اتر )
به عنوان بهترين روش جهت جداسازي و تشخيص تخم كرمها، كيست ، تك ياخته ها وغيره مي باشد.
روش استاندارد رسوب سازي ((Sedimentation Standard Methods
روش استاندارد فرمالين -اتيل استات ( اتر )
جهت جداسازي همه انواع تك ياخته ها ، اووسيست ها ، تخم كرم ما و لاروها مناسب مي باشد. در اين روش ارگانيسمهاي سنگين تر در مقايسه با عناصر سبك تر محلول زودتر ته نشين ميشوند و علاوه بر مراحل سانتريفوژ ، مراحل صاف كردن و از بين بردن چربي را شامل مي گردد. در مرحله صاف كردن قطعات بزرگ و مواد اضافي مدفوع بوسيله صاف كردن از طريق چند لايه گاز مرطوب گرفته مي شوند.
تركيبات از بين برنده چربي شامل اتر ، اتيل استات ، Hemo-De و يا تركيبات گزيلل (xylene)مي باشد كه چربي هاي
مدفوع را حل كرده و مواد اضافي را شناور مي سازد ، اما به تخم كرمها ، لاروها و يا كيست پروتوزوئرها آسيبي نمي رساند .
معمولاً در اين روش تروفوزوئيت تك ياخته ها خراب شده و يا از بين مي رود.
مناسب ترين روش تغليظ استفاده از اتيل استات و تركيبات ديگر مانند Hemo-De به جاي اتر است كه علت آن حفظ
سلامتي افراد مي باشد . اين تركيبات دقيقاً همان عمل اتر را انجام مي دهند .
روش هاي تغليظ را مي توان روي نمونه هاي نگهداري شده در Polyvinyl Alcohol=PVA انجام داد ، اما ممكن
است در مرحله از بين بردن چربي ، بعضي از ارگانيسمها بخصوص پروتوزوئرها خراب شوند. بنابراين همانطور كه در جزوه
قبلي ذكر گرديد بهتر است كه عمل تغليظ را روي نمونه هاي نگهداري شده در فرمالين و عمل رنگ آميزي را روي نمونه هاي نگهداري شده در PVA انجام داد .
براي نمونه هاي آبكي بايد استفاده از يك مرحله سانتريفوژ ( 10دقيقه در دورg 500) جايگزين روش تغليظ معمولي گردد.
( روش صحيح محاسبه تعداد دور در دقيقه بر اساس شعاع كه در سانتريفوژهاي مختلف ، متفاوت است ، در كتب مرجع موجود مي باشد. )

مواد و معرفهاي لازم :
ا- مواد از بين برنده چربي مانند اتيل استات وغيره
2- فرمالين 5 يا 10 درصد بافر شده و يا Sodium Acetate-Acetic Acid-formalin=SAF
3- NACL 85 /0% 4-محلول لوگل
روش كار :
ا- حدود 4 گرم ازمدفوع تازه را در داخل 10 ميلي ليتر فرمالين 10% (در يك ظرف مناسب از نظر حجم نهايي ) مخلوط كرده و اجازه دهيد كه جهت ثابت شدن عناصر انگلي موجود درمخلوط،بمدت حدإقل 30دقيقه بماند. اگر نمونه در محلول نگهدارنده مانند فرمالين 5يا10درصد و يا SAF تهيه گرديده است ، آن را كاملاًمخلوط كنيد.
2-در رابطه با قوام و مقدار مدفوع،تعداد كافي گاز مرطوب را روي هم قرارداده و سپس آن را داخل قيف بگذاريد. قيف را داخل يك لوله ته مخروطي 10 ميلي ليتري و يا لوله هاي مخصوص سانتريفوژ قراردهيد. شكل ته لوله بايد به نحوي باشد كه مقداركافي رسوب ( ml1 يا ml 5/0) ايجاد كند. معمولاً8 ميلي ليتر از مخلوط فرمالين و مدفوع آماده شده ،صاف مي گردد ..اگر نمونه در ماده نگهدارنده فرمالين يا SAF نگهداري شود،حدود 3 ميلي ليتر از آن كافي است مگر اينكه نمونه حاوي مقدار خيلي كمي مدفوع باشد.
3- محلول سرم فيزيولوژي را تا نوك لوله اضافه كنيد و بمدت 10دقيقه دردور g 500 سانتريفوژ نمائيد.
4- روي محلول را خالي كنيد ، رسوب بدست آمده بايد حدود 5/0 تا ا ميلي ليتر باشد . دوباره رسوب را در سرم فيزيولوژي به حالت سوسپانسيون درآورده و تا نوك لوله را پر نمائيد و مجدداً بمدت 0 ا دقيقه در دور g 500 سانتريفوژ نمائيد.
در صورتي كه بعد از مرحله اول شستشو ، تفاوت رنگ كمي بين رسوب و مايع رويي مشاهده گرديد مي توان مرحله دوم
شستشو را حذف نمود و اگر محلول رويي تيره بوده و يا كدورت زيادي داشت مايع رويي را خالي نموده و دوباره عمل
سانتريفوژ را با محلول سرم فيزيولوژي تكرار كنيد.
5- مايع رويي را خالي نموده و آنقدر فرمالين10% به رسوب ته لوله اضافه نمائيد كه 3/2 لوله را پر نمايد سپس اجازه دهيد
كه قبل از اضافه كردن مواد از بين برنده چربي ، بمدت حداقل 10 دقيقه بماند.
اگر مقدار رسوب ته لوله خيلي كم ، و يا نمونه اصلي محتوي مقدار زيادي موكوس باشد ، مواد از بين برنده چربي را
( مرحله 6 ) اضافه ننمائيد و به عوض آن مقداري فرمالين اضافه و آن را سانتريفوژ نموده و سپس مايع رويي را خالي
كرده و رسوب باقي مانده را بررسي نمائيد.
6- 4 تا 5 ميلي ليتر اتيل استات و يا ديگر مواد از بين برنده چربي را اضافه كنيد. در لوله را با چوب پنبه ببنديد و آن را
حداقل بمدت 30ثانيه به شدت تكان دهيد . لوله را طوري نگه داريد كه چوب پنبه دور از صورت شما و يا همكارتان باشد.
7- 5 ا تا 30ثانيه صبر كنيد و سپس با دقت چوب پنبه را برداريد.
8-آن را بمدت 0 ا دقيقه در دور g 500 سانتريفوژ كنيد . بعد از سانتريفوژ 4 لايه تشكيل مي شود . اولين لايه مقدار كمي
رسوب ( حاوي انگل ) است كه در ته لوله تشكيل مي شود.لايه بعد فرمالين مي باشد و سپس آشغالهاي مدفوع روي سطح لايه فرمالين قرار گرفته و بقيه مواد از بين برنده چربي در نوك لوله قرار مي گيرد.
9- بوسيله اپليكاتور تمام آشغالهاي مدفوع را خارج كرده وسپس همه محلول رويي را خالي نمائيد و در حاليكه لوله را سرازير
نگه داشته ايد ، بوسيله اپليكاتوري كه در سر آن پنبه پيچيده شده است و يا بوسيله سواب همه آشغالهاي چسبيده به ديوار را خارج نمائيد.. سپس لوله رابه حالت اوليه برگردانيد.
وقتي كه از لوله هاي شيشه اي استفاده مي كنيد مايع خيلي راحت تر به ته لوله بر مي گردد. اگر نمونه حاوي مقدار زيادي
موكوس باشد مقدار سديمان به حداقل مي رسد در اين حالت جهت خارج نمودن مايع رويي ، لوله را وارونه نكنيد. زيرا
ممكن است همراه اين عمل رسوب را از دست بدهيد. در اين صورت مايع رويي را بوسيله پي پت پاستور و غيره خارج نمائيد.
10- هنگامي كه رسوب به ته لوله چسبيده و سفت است يك يا دو قطره سرم فيزيولوژي و يا فرمالين به آن اضافه نموده
و مخلوط نمائيد. سپس مقدار كمي از آن را روي لام گذاشته ويك لامل با اندازه 22× 22 روي آن قرار دهيد. ممكن است
از لامل با اندازه 40 × 22هم استفاده نمود. اما معمولاًبيشتر از لامل 22× 22 استفاده مي شود.
11- معمولا ابتدا با بزركنمايى ( 10 × ) تمام محدوده لامل را بررسي نمائيد.
12- اگر مورد مشكوكي مشاهده گرديد از عدسي با بزرگنمايي (40×) براى برر سي بيشتر جزئيات استفاده كنيد. حداقل3/1
محدوده لامل را بايد با عدسي با بزرگنمايي (40×) بررسي كنيد ، حتى اگر مورد مشكوكي مشاهده نگرديد .
– اكرچه بعضي از افراد اطراف لامل را بوسيله پارافين وغيره مسدود كرده و با عدسي با بزرگنمايي ( 100 × ) آن رابررسي
مي كنند . اما معمولاً اين كار انجام نمي شود وتشخيص صحيح تك ياخته ها بوسيله تهيه لام رنگ آميزى انجام مي پذيرد.
13- مي توان لام تهيه شده را جهت بررسي بيشتر و يا آموزش به افراد در يك پليت محتوي كاغذ يا پنبه مرطوب روي يك اپليكاتور يا وسيله نگهدارنده لام قرار داد. فضاي محفظه بايد كاملاً مرطوب بوده ، اما خيس نباشد.
– ممكن است كيست تك ياخته ها ، اووسيست،، تخم كرمها و لارو ها درآماده سازي با روش تغليظ با تعداد بيشتري در مقايسه با روش مستقيم مشاهده كردند.
روش صحيح گزارش نتايج به همان ترتيبي خواهد بود كه در جزوه قبلي اشاره گرديد.

نكات قابل توجه
– در تمام مراحل روش كار استفاده ازآب لوله كشي مي تواند جايگزين استفاده از سرم فيزيولوژي گردد اما بعضي از كاركنان ترجيح مي دهند كه در تمام مراحل از فرمالين 10% استفاده كنند.
بهرحال اكر در مورد نمونه هاي تازه ويا نگهداري شده در فرمل از آب لوله كشي استفاده كنيد بارها مشاهده گرديده است كه انگلBlastocystis hominis از بين رفته است و يا ارگانيسمهاي آلوده كننده اي كه زندگي آزاد دارند در نمونه مشاهده گرديده اند.
– توصيه مي شود كه استفاده از اتيل استات جايگزين استفاده از اتر گردد . همچنين استفاده از حلالهاي ديگر مانند Hemo-De كه بي خطرتر از انواع ديگر بوده ، توصيه مي گردد.
– بعد از اينكه در مرحله آخر روش تغليظ ، مايع رويي را خارج نموديد ، در حاليكه هنوز لوله وارونه است ، كناره هاي آن را با يك سواب پنبه اي تميز كنيد كه اضافي ماده از بين برنده چربي خارج گردد. اين عمل مخصوصاً در مواردي كه از لوله هاي پلاستيكي استفاده مي شود ، مهم است . چون اگر اين مواد وارد رسوب موجود در لوله گردد در زير ميكروسكوپ حبابهايي را ايجاد مي كند كه باعث مي شود كه مواد و عناصر مورد نظر پوشانده شوند و يا به سختي مشاهده گردند و همچنين در هنگام تهيه گسترش سوسپانسيون تمايل دارد كه در وسط لام تجمع حاصل كند و تهيه يك گسترش خوب به سختي امكان پذير است .
– اگر نمونه ها در ماده نگهدارنده (SAF) نگهداري شوند ، روش انجام آزمايش تغليظ از مرحله2 ) شروع خواهد شد.
– اگر نمونه ها در (PVA) نگهداريشوند مراحل ا و 2روش انجام آزمايش تغليظ بايد به شرح زير اصلاح گردد. مدفوع و PVA را بوسيله يك اپليكاتور مخلوط نمائيد.سپس حدود نيمي از آن را به داخل يك لوله مناسب ريخته و با سرم فيزيولوژي تا سر لوله را پر كنيد. حدود3ميلي ليتر از مخلوط سرم فيزيولورى ، PVA و مدفوع را از طريق گاز مرطوب كه داخل قيف گذاشته ايد ، به داخل لوله سانتريفوژ 15 ميلي ليتري صاف كنيد و سپس بقيه مراحل را از مرحله 3 ادامه دهيد. .
– عليرغم نوع ماده نگهدارنده استفاده شده ، رسوب خيلي غليظ و يا خيلي رقيق مي تواند بيانگر روش تغليظ غير صحيح باشد.
محدوديتهاي روش:
– تك ياخته هاي مشاهده شده در آزمايش مستقيم بايد بوسيله روش رنگ آميزي دائمي تائيد شوند.بعضي از تك ياخته ها كوچك بوده و تشخيص آنها در آزمايش مستقيم نمونه مشكل مي باشد.حتي اگر نوع انگل در آزمايش مستقيم تشخيص داده شود،جداسازي آن انگل با روش رنگ آميزي دائمي، تشخيص را تاييد مي كند.
– مخصوصاً تاييد تشخيص در مواردي كه انگل آنتاموباهيستوليتيكا جدا ميگردد ، بسيار مهم است كه اين امر در مورد انگل انتاموباكلي صدق نمي كند.
بعضى از ارگانيسمها مانند ژيارديا لامبليا ، تخم هاي كرم قلابدار و بعضي مواقع تخمهاي كرم تريكوسفال ممكن است در روش تغليظ انجام شده با مدفوعي كه در PVA نگهداري شده بخوبي مدفوعي كه در فرمالين نگهداري شده ، حفظ نگردند.
بهر حال در مواردي كه آلودگي به انگلهاي فوق به ميزان متوسط تا شديد باشد ،اين مشكل كمتر مشاهده مي گردد. همچنين شكل لار وهاي استرونژيلوئيدس استركوراليس و كيستهاي انتاموباكلي در نمونه تغليظ شده مدفوعي كه در PVA نگهداري شده بخوبي نمونه هاي نگهداري شده در فرمالين مشخص نمي باشند.
به طور معمول اووسيست ايزوسپورابلي (Isospora belli) در رسوب نمونه تغليظ شده مدفوعي كه در PVA نگهداري شده ، حفظ نگرديده و تخريب مي گردد.

آزمایش تغلیط نمونه مدفوع به منظور تغلیظ تخم، کیست، لارو و تروفوزوئیت انگلها برای تشخیص دقیقتر بصورت روزانه در آزمایشگاه تشخیص طبی در اصفهان دکتر شریفی انجام می شود.

[/vc_column_text][/vc_column][/vc_row][vc_row][vc_column][cz_gap][/vc_column][/vc_row]