تشخیص کریپتوسپوریدیوزیس

Diagnosis of cryptosporidiosis

کریپتوسپوریدیوم [1] تک یاخته‌ی زئونوز انگلی می‌باشد که اغلب در کودکان زیر 5 سال با سیستم ایمنی سالم و افراد بزرگسال با سیستم ایمنی ناکارآمد[2] مخصوصاً افراد مبتلا به ایدز ایجاد کریپتوسپوریدیوزیس[3] می‌نماید. این انگل در افراد با ایمنی سالم ایجاد اسهال 1 تا 2 هفته‌ای (مواقعی تا 5/2 ماه) می‌کند، اما در افراد با سیستم ایمنی نا کارآمد بیماری شدیدتری ایجاد کرده و حیات بیمار را به مخاطره خواهد انداخت. تیزر[4] در سال 1907 این تک یاخته را در موش شناسایی کرد. این تک یاخته تا قبل از سال 1976 به عنوان انگل دستگاه گوارش بسیاری از مهره داران از جمله پرندگان و پستانداران گزارش می‌شد و در این سال برای اولین بار دو مورد کریپتوسپوریدیوز انسانی توسط نایم و میسل گزارش گردید. سازمان جهانی بهداشت[5] این انگل را به عنوان انگلی با دوز عفونت زایی پایین و مقاوم به پروسه کلر زنی آب آشامیدنی معرفی کرده است. اواوسیست‌های تمام سوشهای انگل کروی و 2 تا 6 میکرون قطر دارند و مشابه سایر اسپوروزواها، چرخه جنسی و غیر جنسی دارند. اواوسیست آلوده کننده با مدفوع به خارج راه پیدا می‌کند. بر خلاف ایزوسپورا و توکسوپلاسما، اواوسیست کریپتوسپوریدیوم در زمان دفع با مدفوع کاملاً رسیده و آلوده کننده است که پس از ورود به بدن فرد دیگر اسپروزوایت ها از آن خارج شده و خود را به سطح اپیتلیالی روده متصل می کنند و چرخه تکاملی جدیدی را آغاز می نمایند. این انگل بعلت اینکه خارج از سیتوپلاسم قرار گرفته اما با یک غشاء مضاعف با منشا میزبان محصور می‌شود، آنرا انگل داخل سلولی و خارج سیتوپلاسمی به حساب می آورند.
در سال 1976 دو گروه از محققین بصورت جداگانه کریپتوسپوریدیوم را از دو انسان مبتلا به اسهال آبکی شدید گزارش نمودند. سومین و چهارمین گزارشهای انسانی در سالهای بعد از افراد نقص سیستم ایمنی گزارش شد. در سال 1993 بعلت طغیان بیماری در شهر میلواکی[6] که بالغ بر 403000 نفر آلوده شده بودند، کریپتوسپوریدیوزیس دوباره مورد توجه محققین قرارگرفت. در نهایت اواخر دهه 1990 روشهای مولکولی برای شناسایی این انگل ابداع و اساس تاکسونومی انگل شد و با شناسایی ساب تایپ‌ها، پروتئومیکس[7]، ژنوم انگل، مطالعات بیوشیمیایی شروع وادامه یافت. در دهه اخیر بیشتر مطالعات روی جنبه های مولکولی، تشخیص و جنبه های انتقال کریپتوسپوریدیوم بوسیله آب متمرکز شده‌اند.

با وجود اینکه کریپتوسپوریدیم در سال 1907 برای اولین بار شرح داده شد، اما 50 سال در حیوانات مزرعه ای و 70 سال برای انسان، طول کشید تا به عنوان پاتوژن اعلام شود. علت اصلی این تأخیر به علت نبود یک روش تشخیصی مناسب در نمونه های کلینیکی بود. بین سالهای 1978 تا 1980 رنگ آمیزی گیمسا برای رنگ آمیزی و تشخیص کریپتوسپوریدیوم در نمونه های مدفوع انسان استفاده می‌شد. در سال 1981 رنگ آمیزی زیل نلسون اصلاح شده توسط هنریکسن و پولنز[8] برای تشخیص این انگل استفاده شد.

انواع روشهای تشخیصی کریپتوسپوریدیوزیس:

1- روشهای میکروسکوپی (پارازیتولوژی): از این روشها می توان رنگ آمیزی زیل نلسون اصلاح شده و اورامین فنل را نام برد. روشهای میکروسکوپی معمول از حساسیت پائین ولی از ویژگی بسیار بالایی برخوردار هستند. این روشها بعلت سهولت انجام و نیاز به امکانات کمتر، مناسب برای آزمایشگاههای تشخیص طبی می باشند، اما برای تشخیص اووسیستهای این انگل نیاز به یک تکنسین ماهر خواهد بود. در هر دو روش زیل نلسون اصلاح شده و اورامین فنل اووسیست‌های انگل با رنگ و تلألو متفاوت نسبت به زمینه قابل شناسایی خواهند بود.
2- روشهای ایمنولوژیک: شامل روشهای شناسایی آنتی ژن توسط آنتی بادی های منوکلونال متصل به مواد فلوروسنت مانند if[9] . شناسایی آنتی ژن توسط آنتی بادی متصل به گوده توسط آنزیم (آنزیم ایمنواسی و الایزا)[10] و ایمنوکروماتوگرافی (IC)[11].
3- روشهای شناسایی آنتی بادی: شامل EITB[12] و الایزا با استفاده از پروتئین های نوترکیب. روشهای سرولوژیک چندان کارایی نداشته و با روشهای کوپرولوژیک همخوانی ندارند.
4- بیوپسی از مخاط روده و تهیه مقاطع پاتولوژیک: این روش بعلت تهاجمی بودن فقط برای مطالعات و یا در شرایط خاص استفاده می‌شود.
5- روشهای ملکولی با پایه‌ی PCR: حساسیت بالایی نسبت به روشهای معمول رنگ آمیزی و ایمنولوژیک دادند. حساسیت این روشها تا یک اواوسیست در گرم مدفوع می باشد. روشهایی مانند شناسایی سکانس ژن18s rRNA ، سکانس ژن کد کننده پروتئین [13]COWP، [14]MAS-PCR و Quantitative Real-Time PCR در شناسایی عفونت بکار گرفته شده است.
مزایا و معایب روشهای تشخیص کریپتوسپوریدیوزیس، اقتباس از Cryptosporidium

mZN: زیل نلسون اصلاح شده، AP: اورامین فنل، IF: ایمنوفلوروسنت، EIA: آنزیم ایمنواسی،
IC: ایمنوکروماتوگرافی؛ + = معمولی، ++ = خوب، +++ = خیلی خوب، ++++ = عالی
روشهای رنگ آمیزی بعلت سهولت انجام برای آزمایشگاههای تشخیص طبی و نیاز به امکانات کم می توانند بصورت روتین در آمده و در آزمایشگاهها انجام شوند. لذا بطور مختصر در ادامه توضیح داده می شوند.
روش اورامین فنل فلورسنت:
در روش اورامین فنل، اووسیستها رنگ اورامین (Poyktamin® YeLLOW)را به خود گرفته، در مجاورت اسید‌-الکل (3% هیدروکلریک اسید در متانل) رنگ پس نداده و در زمینه پرمنگنات پتاسیم 1/0% با میکروسکوپ فلوروسنت دارای فیلترهای FITC با انتشار nm 510 و نور UV با انتشار nm 450 بصورت کروی با تلألو زرد متمایل به سبز قابل تشخیص هستند.
روش رنگ آمیزی زیل نلسون اصلاح شده سرد:
روش رنگ آمیزی زیل نلسون اصلاح شده سرد نیز مشابه رنگ آمیزی اخیر، اووسیست ها رنگ کربول‌فوشین را در مجاورت اسید-الکل (1% هیدروکلریک اسید در متانول) پس نداده و در رنگ زمینه متیلن بلو یا مالاشیت گرین زیر میکروسکوپ نوری با عدسی 100 به رنگ قرمز با حدود اندازه تقریبا 6-2 میکرون دیده می‌شوند.
– طرز تهیه رنگ کربول فوشین برای رنگ آمیزی زیل نلسون اصلاح شده:
ده گرم از پودر فوشین را در 100 میلی لیتر اتانول 90% حل کرده و 50 میلی لیتر فنل مایع به آن اضافه می شود. در قدم بعدی حجم محلول تهیه شده را با آب مقطر به 1000 میلی لیتر رسانده و در ظروف عایق نور نگهداری می شود. رنگ تهیه شده تا 3 ماه در دمای آزمایشگاه قابل نگهداری است.
-مراحل رنگ آمیزی:
ابتدا فروتی نازکی ار نمونه مدفوع با استفاده از سرم فیزیولوژی تهیه و بعد از خشک شدن در مجاورت هوای اتاق با چند قطره متانول فیکس کرده و روی رک رنگ ‌آمیزی قرار داده می شوند.گسترش هاي فيكس شده بمدت 15 دقیقه یا داخل رنگ کربول‌فوشین سرد قرارد داده می شوند و یا رنگ روی لام‌ها ریخته می شود. بعد از 15 دقیقه لامها در آب شیر غوطه ور شده تا رنگ اضافی روی آن شسته شود. در مرحله بعد لامها با استفاده از متانول حاوی 1% هیدروکلریک اسید بمدت 10 تا 15 ثانیه رنگ بری شده و دوباره با آب شیر شستشو داده می شوند. در مرحله بعد اسلایدها با رنگ زمینه مالاشیت گرین 4/0% بمدت 30 ثانیه رنگ آمیزی شده و بعد از شستن لامها با آب شیر در مجاورت هوا خشک شده و زیر میکروسکوپ زیر عدسی 100 با روغن ایمرسیون بررسی می‌شوند. اواوسیست های کریپتوسپوریدیوم به رنگ قرمز با حدود اندازه تقریبا 6-2 میکرون قابل تشخیص هستند.

اواوسیست های کریپتوسپوریدیوم در مدفوع انسان با رنگ آمیزی زیل نلسون اصلاح شده (a) و اورامین فنل (b) (اقتباس از Jafari et al. 2013)
با توجه به اینکه بخش انگل شناسی در آزمایشگاههای تشخیص طبی مورد غفلت قرار می گیرد، تشخیص عوامل عفونی انگلی مخصوصاً کریپتوسپوریدیوم ندرتاً بصورت روتین در آزمایشگاهها انجام می شود. امید است با آشنایی هرچه بیشتر پزشکان و آزمایشگاهها با این انگل نوظهور گامی موثر در تشخیص و درمان عوامل اسهال‌های ناشناخته برداشته شود.

استفاده از مطالب سایت فقط با ذکر منبع، نویسنده و لینک این صفحه امکانپذیر است
دکتر رسول جعفری، گروه انگل شناسی دانشگاه علوم پزشکی اصفهان